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核磁共振

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在國內核磁共振光譜儀之使用已有二十幾年的歷史,所提供的研究大多以化學位移(chemical shift)及自旋-自旋間耦合(spin-spin coupling),.做化合物構造鑑定之用,但目前已經增購許多新型核磁共振光譜儀,具備許多新功能,例如可做二維核磁共振光譜固及多重脈衝實驗而得到局部光譜圖,或者因研究需要而改變脈衝序列,這些新的功能,對各方面的研究提供更多且詳細的資料,然而對脈衝核磁共振原理及應用,核弛緩(nuclear relaxation)的問題相當重要。國內一般人對化學位移及自旋間耦合較熟悉,而疏於對核弛緩原理之瞭解,因此本文對此部份做粗淺的介紹,以實例說明核弛緩的觀念。

簡介
核磁共振光譜(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer)基本上和紫外線(Ultraviolet, UV)、紅外線(Infrared, IR)光譜類似,是光譜分析重要的一支,在紫外線光譜和紅外線光譜,只要有穩定的光源(source),經過濾光鏡,得到樣品中分子可吸收的單色光,即有吸收光譜。但是核磁共振則需在磁場(Zeeman field) 的作用下,具有磁矩的核才能產生能階分裂(energy splitting),其能差落在無線電磁波範圍 (radio frequency,l03~108 Hz,氫核在地磁能階分裂為2x103Hz),與較高頻率(較短波長)的紫外光譜(electronic transition, 1014 Hz) 和紅外線光譜(vibrational transition, l012 Hz) 有下列三點差異:

1. 「核磁共振光譜是使用無線電磁波發生器(radio frequency generator) 所產生之無線電磁波使核激發,此無線電磁波發生器具非常小的頻率寬度( Du<<譜線寬度),在固定頻率,只要小能量即可產生許多光子(Photons),光子多則受激發而導致誘發遷移(stimulated transition)的機率大於自發的機率,但是在紫外及紅外線光譜,使用一般光源(source),其頻寬遠大於譜線寬度( Du>>line width),必須經單色分光器來選擇某一單波長,因此所得的單色光強度弱,此缺點可使用雷射做光源來彌補。

2. 無線電磁波其頻寬窄、光子多,若以波的性質來看,依測不準原理(uncertainty principle),DnDy~ h(constant),光子多(Dn大)則相之間差小(Dy小),因此產生同相(coherence),在激發狀態此種同相的磁矩經過生命期T2,後,﹒因為自旋-自旋之間能量交換,所以使得公轉(Precession)速度快慢不同,便失去相位關聯而導致淨磁矩量表褪(此稱為去相),依測不準原理可知其激發狀態能層誤差在大約h / T2,導致核磁共振吸收光譜有其譜線寬度,而從此寬度可測得T2,從同相至去相是一種弛緩(relaxation)現象。此一過程謂之自旋-自旋弛緩,稱T2為自旋-自旋弛緩時間。

3. 依據黑體輻射理論,自發發光(spontaneous emission)和頻率的三次方成正比(an3),在紫外線和紅外線光譜範圍,波長短(頻率高)在此範圍有吸收的分子被激發(exciting)後,其自發發光的機率大,而經此機構回到基態(ground state),這些系統不易造成飽和現象(saturation)。在核磁共振因為核自轉之吸收範圍在無線電磁波,頻率低、能階差小且自發發光率小,較易達到飽和現象,其由激發態回到基態過程的速率完全是由弛緩的機構控制,在弛緩過程中將能量轉移至分子動能上(稱之為晶格運動),故能提供動力學(dynamics)上的資料。而此種弛緩現象約在T1,時間後就消失,故定T1為自旋-晶格弛緩時間。
一般所謂的連續波核磁共振光譜(continuous wave)和紫外、可見光或紅外光譜一樣,其偵測原理是利用樣品吸收光源(或激發源)能量多寡而得光譜。此種核磁共振光譜亦可由自旋-自旋弛緩過程所得的訊號,經由傅立葉轉換至頻率空間而得到,所以弛緩過程以及弛緩前激發準備過程在最近核磁共振光譜學的發展佔了相當重要的角色。諸如在化學分析應用一般常見的一維核磁(1D-NMR)共振光譜,是將化學位移(chemical shift)和自旋-自旋間耦合(spin-spin coupling)在同一座標上顯示,但會有擁擠及重疊的現象,對於較複雜化合物有難以明確辨認之困擾。為了解決重疊現象,最近採用多重脈衝FT-NMR1(Multiple pulse FT-NMR),可做局部光譜編輯,或者應用二維核磁共振2(2D-NMR),將有助於解析的變數以另一空間表示之。在分析材料上由於固體的核磁共振技巧的發展3,材貿測定已可得到較佳的解析度,更由於核磁共振攝影方法(NMR Image method)之發展,在醫學上的應用,補充提供許多其他儀器無法得到的資料,使得NMR在化學、生化上,甚至醫學上有更好的分析結果,更廣泛的用途。

原理
核磁共振是利用具有自旋角動量的原子核在磁場下能階分裂的一基本現象所發展出來的。一般磁矩與其自旋角動量(a)有關m=g1a=g1Ih(g1: 磁轉比(magnetogyric ratio)),氫核的自轉量子數(I)為1/2,磁矩m=gHIh(此時gH=2.6753xl04 radians sec-1 guass-1)在古典觀念上如同一個帶電球體自旋,因此具有磁矩而與外加磁場作用,其所允許之量子態為2I+1等於2個,即是m(磁量)等於 m1/2gHh (可想像成順磁場和逆磁場約兩個能態)。在無外加磁場下,這二個量子態能量相等(degeneracy),因此也就無法得核磁共振,但若加入一個外加磁場和磁量作用,此二個量子態便能分裂,它們之間形成了一個能量差,依照波茲曼分配率,此種磁核在高能階狀態的分佈較少,在低能階狀態的分佈多,我們舉一個例子來說明此一分佈,如果在室溫(25oC) 下有一試料含一莫耳之氫核放置在23500高斯(約地磁之3萬倍)之磁場中(Ho=23,500G)。
圖一,上下兩條線分表代表高低能階,核狀態和外在磁場方向平行時以h表示之,反向時以i表示之。在平衡狀態下,按照波茲曼分配(ae-E/kT)(圖一)可以算出在低能階約有3,000,000x1017 個,高能階上有2,999,976x1017 個,二者相差只有百萬分之八而已。若在垂直於磁場方向加入無線電磁波於此系統,其頻率(n)剛好對應於這二個能階之差(hn),它就誘發了這二個能階上分佈的轉移,此時高能階上的分佈,若激發所用的電磁波強度夠大時,高能階之分佈開始大於波茲曼分佈律所得的結果,若高低能階分佈相等 ,則達到飽和現象。若激發源繼續施加時,高能階會比低能階有較多的分佈,此種現象稱之為此系統具"負"溫度(波茲曼分配率之溫度為"負"。)。當電磁波消失時,在高能階上狀態漸漸回復平衡時之波茲曼分佈,跳回低能階而放出能量,這個過程就是在前面所謂的自旋-晶格弛援現象,又因此過程牽涉到垂直方向磁矩的變化,所以又叫垂直弛緩過程。

當一自旋核被置於一均勻外磁場(Ho),則此磁場對核磁體產生一轉動力矩,促其繞場作陀螺式公轉,其公轉角速度wo,等於磁轉比g(mgnetogyric ratio)與磁場強度Ho之乘積(Larmor equation wo=gHo),此頻率稱 Larmor frequency。在剛激發後,若站在一繞Z軸旋轉的座標上,其旋轉角速度亦為wo時,則看到淨磁量(即在前節所述剛激發後同相的磁矩)靜止水平方向。此座標軸稱之為旋轉座標軸(當共振時,在旋轉座標上無Zeeman field的作用,這好比在人造衛星上感覺不到地球重力場一樣)。而後此靜止於水平方向的磁量也因自旋核問的能量交換導致去相。

前面提及之弛緩時間T1,及T2之測量,可加入不同的脈衝破壞原來之平街狀態,在移開脈衝後,觀察恢復到原來平衡狀態的過程而測得。所施加的脈衝,習慣上稱之為某角度脈衝,比如說90度脈衝是指在共振時所用電磁波磁場振幅H1和施加脈衝時間為t則有g1H1t=p/2的關係,如施加時間為2t時,可得知為180度脈衝。在旋轉座標軸上90度脈衝是將平衡時間將沿Z軸的淨磁矩轉90度至水平面上,180度脈衝是將淨磁矩轉至一Z軸上。此種旋轉和 Lamor precession之原理相同,因在旋轉座標上有效的磁場只有H1,其角速度為g1H1,所以沿H1,旋轉90度所需的時間為t=p/2/g1H1。

在自旋-晶格弛緩(Spin-lattice relaxation)過程時釋出之能量由物質本身吸收,由於能量很小,物質本身之溫度不致於改變(除非在極低溫(<10 oK)),此過程進行之快慢受到分子構造、溶液黏滯性、溫度等影響,尤其是樣品中存在之順磁物質,使得弛緩較快。因此可以利用T1來探討物質內分子動力現象,如分子構造、作用及擴散作用等之應用。此要探討垂直方向磁矩的變化,有Zeeman磁場存在下,對平衡磁矩加以90度脈衝後,所測得磁矩可由下式表示之

Mz(t)=Mz0(l-e-t / T1)

T1是弛緩常數,如果t >>T1,時,則e-t / T1接近於零,因此Mz恢復至平衡值Mz0。由上可知T1愈短愈容易回到平衡狀態,T1愈長,則回到平衡狀態需較長的時間。

自旋-自旋弛緩(spin-spin relaxation)是探討橫方向磁矩的變化,又稱為水平弛緩(transverse relaxation),如加以90度脈衝破壞平衡所測得在旋轉座標之磁矩可由下式表示之:

MxR(t)=MxR(o)2

MxR(o)是指當H1,在旋轉座標之y軸,90度脈衝剛移開後同相之磁矩,其方向在x軸。有關T2之應用在後面詳述之。

T1和T2測定方法的探討

l. T1(longitudinal relaxation time)之測定

(a) 反轉-回復法(Inversion-Recovery)5方法:


首先在y軸方向(參看圖二),給一個180度脈衝,便在z軸方向的磁矩Mz反轉180度,此時 磁矩為Mz(0),經過t時間後,再於y軸方向給予90度脈衝,把剩餘的磁矩轉至x軸加以偵測,所得訊號At。,為Mz(0)經t時間後剩餘之淨磁矩。在大於5倍T1時間後,讓磁矩恢復其平衡值再重覆不同t時間之180度-t-90度脈衝序列,可得At的衰減速率,由ln(Ah-At)對t作圖,所得斜率的倒數即為T1,其中At是經過t時間後給90度脈衝所得之訊號,Ah是指180度和90度兩個脈衝間隔很長的時間之訊號,即為儀器測得平衡時之淨磁矩。使用此方法,首先必需要預估樣品的T1,然後控制脈衝時間(即脈衝時間寬度)遠小於脈衝與脈衝之間的時間(t),而脈衝與脈衝之間的時間也要小於T,(即pulse duration time<< t<T1),才能測得準確之T1值。假如t>T1時,磁量很快的回到平衡狀態,則無法分析所得訊號,而脈衝時間又必須小於t,否則加入之脈衝尚未結束時,已經開始衰褪(decay),所得訊號並不是經過亡時間後之訊號,因此要測量準確T1,選擇良好的實驗條件定必要的。

(b) 利用90度-t-90度脈衝測量T16
(1)首先在沿y軸方向給一個90度脈衝,使z軸方向的磁矩M,轉至x軸,經過「時間,部份回到z軸。再給90度脈衝把此部份磁矩轉至x軸加以偵測,磁量Mz(t)=Mz(0) (l-e-t / T1),與(a)方法相同,可以測得T1。
(2)使用此方法的條件是T1>>T2,T2時間若很短,則經t時間後自旋-自旋弛緩已經完
全去相,不會殘餘在x軸上,則測量T1值不受到T2影饗。


2.  T2之測定
(a) Hahn7所提之自旋-回響(Spin-echo)測量T2的方法:

此方法是利用90度-t-180度-2t之脈衝序列,在2t時偵測訊號,詳述如下:

(1)當t=0時,Mz在z軸上(Mz,=Mzo),沿y軸,加入一個90度脈衝.則Mz轉到x軸。
(2)由於磁場的不均勻(源由不均勻的靜磁場,化學位移,異核自旋問的耦合),.使得公轉速度不同,因此在亡時間內會有去相的現象。
(3)再沿y軸給180度脈衝,使得Mz倒轉-x軸。
(4)對於源由不均勻磁場、化學位移,以及異核間耦合所造成的速度差異的核,快的核仍然
以順時針方向運動,而速度慢的以逆時針方向運動。
(5)經過了2t時間,Mz聚合在-x軸,則可測得訊號。經過此x, y方向的運動後,利用MxR(t)=MxR(o)e-t / T2 ,MyR(t)=MyR(o)e-t / T2 ,以不同t時間作實驗,便可由衰褪訊號而得T2。
下面是Hahn方法,以六個不同t時間做實驗所得之訊號之實例圖。

(b)Carr-Purcell,方法測T2:
Carr和Punell在l954年提出二種測量T2的方法,簡單介紹如下:
方法(A): 採用90度-t/2-180度-5T1-FID,每次以不同「的時間做實驗,則由訊號變化與「值的關係可以算出T,。(圖五a)
方法(B): 採用90度-t/2-180度-t-10度-180度,在t/2,3t/2,5t/2…之時間偵測訊號,便可由衰褪情形算出T,(圖五b)。

3. 脈衝角度不正確時對T1測量之影響

T1時間之測量使用180度-t-90度之脈衝序列,若脈衝角度正確時,如前所述可由一系列不同t時間實驗而求得T1(圖六a)。

但若所用的脈衝180度(或90度)並非正確的角度,而有一個f角度偏差,如180度-f(或90
度-f/2)則以下圖示之(圖六b)。

由圖六b之略圖,當180之脈衝角度不正確,而90度脈衝角度正確如圖4,T2不會影響T1之測定,但是若90脈衝角度不正確如圖4'時,若樣品之T2很短,則不會影響T1之測量,若T2不很小於T1,則在x軸上之殘餘量會影響T1之測定。

T1和 T2應用簡介
在本文介紹裏我們說明了弛緩過程,自旋-自旋弛緩速率經由自旋一自旋間能量交換,但交換之時間速率仍像自旋-晶格弛緩一樣受分子運動影響,若分子運動快(大於Larmor frequency),自旋系統和晶格接觸時間短,單位時間內遞交的能量視自旋-晶格作用而定,對同一種自旋-晶格作用,接觸時間短(<<T1,T2),自旋交給晶格的能量較小,因而使自旋系統弛緩減慢,反之接觸時間長,自旋有較長的時間將能量交給晶格而達到平衡狀態,因此核弛緩速率較快。

在下面的應用實例中,就是利用樣品中小分子運動快核弛緩慢,大分子運動慢核弛緩快,進而分析樣品中不同成份的含量。

(a) 利用脈衝NMR迅速決定糖漿在各個過程之含水量
糖漿的製造過程有好幾個階段,因加工程序需要而每個階段含水量不同,可以採用脈衝NMR方法來迅速檢測其中水份的含量。
其製造過程首先用水粹取糖,含水量大約有90%,然後經過壓榨,水含量約80%,最後加入糖蜜,乾燥後其所含水量約12%。在最後階段含水量較少(約12%),可以採用最簡單的90度脈衝NMR方法。

這個方法基本上認為在取訊號之前,固體之弛緩衰褪訊號已完全消失,只有液體之訊號,因此可以由單位重量樣品內質子之自由感應衰褪訊號對時間作圖(參看圖七),再出圖八之校正曲線可以求得樣品含水量。
由圖八中以已知含水量百分比的樣品與其所測得訊號(v/g)作圖,在7.5%到15%幾乎成一直線
的關係,所以此方法非常適用於最後階段含水量較少的過程。
在最初過程含水量有90%,則採用上法不適用,因而採用90度-180度脈衝序列(Pulse-sequence)在時間2t偵測,如圖九。
利用已知水含量百分比樣品對回響訊號得校正曲線,則可得知未知樣品之水含量百分比(參看圖十)。或採用100個Carr-Purcell脈衝序列所得回響的訊號對時間作圖,可以由其斜率求得自旋-自旋弛援速率l/T2(參看圖十一)。然後可出已知水的含量百分比之樣品對弛緩速率作圖,得一條校正曲線(見圖十二),則可得知未知樣品之水含量百分比。
以上這二位方法,操作簡便,只要有桌上型脈衝NMR光譜儀及已設計好的脈衝程式在工廠中,隨時可測得各個過程中之含水量,在一兩分鐘內,便可得到所需的分析資料。

(b)下面介紹一種迅速分析稻米中吸收的水份,水分子中的氫核,因水分子運動較稻米成份帶氫核分子之運動來得快,因此水分子氫核弛緩慢而稻米成份氫核弛緩較快(FID衰減較快),所以可由簡單脈衝來區分不同情況的氫核(參看圖十三a、b),因為NMR的方法是非破壞性的,因此應用在稻穀的選擇是方便可行的方法。

(c)擴散係數之測定,利用質子的自旋一回響方法(spin echo method)可以測量擴散係數(diffusion coefficient),因質子之公轉角頻率與外加磁場成正比,若在外加磁場下,其磁場有一線性梯度,則由於擴散作用,當質子妓散到不同的位宣,便感受到不同的外加磁場,也就使得質子的運動頻率隨之改變,因而使自旋一回響之同相受擴散作用的影響,因角頻率不同而
去相,故此可以由自旋一回響振幅對時間作圖和均勻磁場下的自旋一回響相比較,可以測出樣品之擴散係數。

但此方法有一缺點,對於擴散係數較慢的樣品,需增加其磁場梯度,但磁場梯度增加時公轉頻率變化大,自旋回響變快,若此樣品之擴散慢時,分子擴散在自旋回響衰褪時間內尚未被觀察得到,便無法測得此樣品的擴散係數。最近採用脈衝磁場梯度(Pulsed magnetic field gradient)隨時間改變磁場梯度的方法(以脈衝加入shim coil內造成梯度變化),此即是利用脈衝磁場梯度測量擴散係數,主要的優點是磁場梯度和產生自旋一回響的脈衝並非同時,故磁場梯度之強度可以增加,對於較小擴散係數的樣品即可偵測,其次因為僅在某段時間擴散作用自旋一回響有影響,時間明確,使測量更精確。

(d)核磁共振在醫學診斷之應用

首先我們利用自旋一回響之脈衝弛緩共振可以檢查並區別惡性腫瘤。(malignant tumors)與一般正常組織(normal tissue),因為在惡性組織內其細胞內液(intracelluler water)之秩序度減少了,因而運動較快,T1較長,R. Damadian做一系列實驗,例如以肝癌(hepatoma)其T1為0.826秒,T2為0.118秒,但正常肝臟(normal liver),則T1為0.293秒,T2為0.050秒,因此可以初步判斷組織是否正常,若再使用核磁共振攝影方法4配上表面線圈的應用,則可以看到異常之部份影像,增進診斷之準確性。
(e)利用氫核磁共振當液體層析之感測器
自從1951年Suryan、Forsen、Rupprecht提出,核磁共振當感測器在流動系統比靜相系統所測訊號強度增加5倍,主要的原因是流動液體,可以使已飽和自旋樣品流出,而流入新的未飽和自旋的部份,因此控制流速是相當重要的,例如甲醇(純的)在298oK時T,為9.0秒,需控制流速,使其在感測器的滯留時間比T1短,便可增加無線電波強度,使吸收訊號增加。H-NMR當做高效能液體層析儀的感測器,可得到更多的資料。

結論
核磁共振光譜圖可以提供詳細資料,如化學位移、自旋-自旋間耦合、T1、T2等,尤其是利用多重脈衝傅立葉核磁共振,不但可以做一般核磁共振光譜圖,且可以做局部光譜固及二維核磁共振,在二個座標上顯示所需的資料,對於化合物的鑑定,提供有力的證據,更由於固體核磁共振、核磁共振攝影術之發展,深入到各個層面,成為研究上的一個重要工具。
更重要的是其能量差落在無線電磁波的範圍,hn<<kT,因此誘發吸收和發光以及核弛緩現象可以用眾人所熟悉的古典觀念來解釋、處理,易為接受。本文對於核磁共振的原理概略的介紹,舉例說明其在實驗上的應用,希望能拋磚引玉,引起共鳴,使核磁共振光譜的研究更推廣。若要更進一步的瞭解,參考資料16對其原理有詳細說明,參考資料2對於二維核磁共振之應用及原理敘述,相信對於想更深入探討核磁共振的同學有所幫助。

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